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Pfu DNA高保真聚合酶

产品编号:4002571
包装规格:250U,250Units,1000Units,1000U
产品类别:国产试剂
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Pfu DNA聚合酶是极端嗜热性细菌Pyrococcus furiosus来源的高度热稳定DNA聚合酶,分子量为90 KD。其保真性是普通Taq DNA聚合酶的10倍左右。扩增片段的长度可达5 kb(简单模板)。延伸速度为2min/kb(70~75℃,简单模板可达20s/kb)。该酶具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性,扩增产物具有平末端。

产品组成

ComponentP1021
250U
P1022
250U
P1023
1,000U
P1024
1,000U
Pfu DNA聚合酶(5U/μl)50 μl50 μl200 μl200 μl
10× Pfu   Buffer(Mg2+ Plus)[1]1.25 ml1.25 ml1.25 ml × 21.25 ml × 2
6× Loading Buffer[2]1 ml1 ml1 ml1 ml
dNTPs(2.5mM)[3]-1 ml-1 ml × 2

[1] 10× Pfu Buffer分为Mg2+ Plus与Mg2+ Free两种包装,可方便选择。如无特别说明提供10× Pfu Buffer(Mg2+ Plus)。Mg2+ Free的10×Pfu Buffer提供25 mM MgCl2

[2] 6× Loading Buffer,如有需要可单独购买(Cat. #:M9041)。

[3] dNTPs是dATP、dGTP、dCTP和dTTP等摩尔混合物,P1021/P1023不含dNTPs,如有需要请单独购买(Cat. #:P9011/P9012/P9013)。

活性定义

一个活性单位(U)指用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物,在72℃、30 min内,摄入10 nmol全核苷酸所需的酶量。

保存条件

-20℃保存2年。

质量控制

纯度检测:经质量检测,产品不含脱氧核糖核酸内切酶、脱氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。

功能检测:PCR方法检测无宿主残余DNA,能有效扩增人基因组中的单拷贝基因。

应用举例

1. 配制反应体系

请于冰上配置反应体系,体系大小与组分用量与添加顺序可调整:

OrdinalComponentVolume
(50 μl reaction volume)
Final   concentration
(50 μl reaction volume)
110× Pfu   Buffer(Mg2+ Plus)5 μl
2dNTPs(2.5mM)4 μl0.4 mM
3upstream primer (10 μM)[1]2 μl0.4 μM
4downstream primer (10 μM)[1]2 μl0.4 μM
5Pfu DNA聚合酶(5U/μl)[2]0.5 μl-1 μl2.5U-5U
6template DNA[3]1-4 μl<1μg
7超纯水[4]To 50 μl-
optionalMgCl2(MgSO4)/PCR Enhancer[5]Variable-

[1] 引物终浓度建议范围:0.1-1 μM。特异性差时可降低浓度,效率低时可提高浓度。

[2] 根据目的片段扩增的难易程度调整DNA聚合酶的用量。

[3] 不同模板最佳用量不同,部分DNA模板建议用量如下表(50 μl反应体系)。

TemplateDosage
人类基因组DNA0.1μg-1μg
λDNA0.5ng-5ng
大肠杆菌基因组DNA10ng-100ng
质粒DNA0.1ng-10ng

[4] 可单独订购超纯水(Cat. #:P9021/P9022/P9023)。

[5] 可单独订购25mM MgCl2(Cat. #:P9031)和PCR Enhancer(Cat. #:P9041)。

2. 设定反应程序进行PCR反应

StageTemperatureTimeNumber of Cycles
Initial Denaturation94℃3 min1
Denaturation94℃30 sec25-35
Annealing55-68℃[1]30 sec
Extension72℃Variable[2]
Final Extension72℃5-10 min1

[1] 退火温度应根据Tm值较低的引物来设。

[2] 延伸时间按2min/kb来设最佳(简单模板可达20s/kb)。

3. 分析结果

将产物与loading buffer混匀后进行琼脂糖凝胶电泳,通过凝胶成像设备观察目的条带的扩增情况。如有需要,可进行割胶回收。

无产物或产物量少的改进措施有:1调整退火温度;2减少抑制剂的影响,如提取的基因组DNA中含有抑制扩增的成分,需要高倍稀释(1: 10000)后使用;3采用乙醇沉降洗脱,提高模板DNA的纯度;4使用PCR添加剂,如PCR Enhancer(Cat. #:P9041)、MgCl2(Cat. #:P9031)等可提高产量。

操作注意事项

1 室温下Pfu DNA聚合酶有一定的活性,为避免发生非特异性扩增,请于冰上配置反应体系,并且最后添加Pfu DNA聚合酶或模板DNA。

2 Pfu DNA聚合酶的扩增产物只有平末端,可直接用于平末端连接。如要进行TA克隆,请先进行加A反应,以提高克隆效率。(加A反应:参考如下体系,72℃,15-30min)

PCR(纯化)产物1-7 μl
10× Taq Buffer(Mg2+ Plus)1 μl
dATP0.2 mM
Taq DNA聚合酶5U
超纯水To 10 μl

3 碱基出错率是指在每个碱基合成过程中所掺入的错误核苷酸数目。Pfu DNA聚合酶的碱基错误率为1×10-6

4 dUTP、dITP和含有这些核苷酸的引物不能用于Pfu DNA聚合酶催化的PCR扩增。因为该酶与含有尿嘧啶和次黄嘌呤的DNA模板结合后会中止DNA聚合反应。

引物设计注意事项

引物长度一般在15-30个碱基之间;上下游引物3’末端避免互补,避免出现3个以上重复的G或C,或出现发夹结构,否则会产生非特异性扩增;GC含量控制在40-60%,且上下游引物GC含量尽量接近;Tm值控制在55-65℃之间,且上下游引物Tm值尽量接近,额外附加序列(酶切位点、修饰等)是非模板匹配序列,不参与Tm值计算。

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