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蛋白质印迹——膜选择
2022.11.29   点击2887次

PVDF膜和NC膜作为Western印迹应用中最常用的两种类型的膜,各有什么特点?我们该如何选择?

印迹所使用的膜的类型可能影响下列因素:

•蛋白质结合能力

•是否需要用醇预湿

•开展多次剥离(stripping)和再生检测(reprobing)实验的能力

•蛋白质观察

•长期印迹保存

•信噪比

聚偏二氟乙烯(PVDF)和硝酸纤维素是Western印迹应用中最常用的两种类型的膜。

与硝酸纤维素膜相比,电转到PVDF膜上有许多优点。PVDF膜可提供更好的蛋白质截留率、物理强度和广泛的化学兼容性(Pluskal等,1986)。其中更高的机械强度和出色的耐化学性让PVDF膜成为免疫检测中各种染色应用和二次检测的理想选择。使用PVDF膜的另一个优点是,单块凝胶上的平行重复泳道可用于各种应用中,如考马斯蓝染色,接着切割条带进行N端测序,蛋白质水解/肽段分离/内部测序,以及免疫检测(Kurien等,2003)。市售的硝酸纤维素膜的典型结合能力是80 – 100 μg/cm2,而PVDF膜的结合能力是100 – 200 μg/cm2

在检测血清中人免疫缺陷病毒(HIV)时直接比较PVDF和硝酸纤维素膜,结果表明,PVDF膜有着更好的总体HIV抗原截留率,并且有助于改善提高抗体对糖基化包膜抗原的检测(Lauritzen和 Pluskal,1998)。硝酸纤维素膜和PVDF膜的特性比较详见表1。

表1. PVDF和硝酸纤维素膜特性及应用的比较

特性/应用硝酸纤维素PVDF
物理强度
蛋白质结合能力80 – 100 μg/cm2100 – 300 μg/cm2
耐溶剂性
Western转移
总蛋白染料胶体金胶体金
丽春红丽春红
氨基黑氨基黑
印度墨汁印度墨汁
Sypro®印迹染料考马斯蓝染料
检测显色显色
化学发光化学发光
荧光荧光
放射性化学荧光

放射性
双印迹方法
快速免疫检测
Western再次杂交
Edman测序
氨基酸分析
SDS存在下的结合
膜上消化或质谱分析
直接MALDI-TOF MS分析
数据可存档

默克密理博提供四种PVDF膜:

• Immobilon®-P膜(0.45 μm)是一种通用的基质,适用于一般的免疫印迹应用。

• Immobilon®-PSQ膜(0.2 μm)适用于蛋白质测序和低分子量蛋白的免疫印迹。它有着更高的蛋白质结合能力以及比0.45 μm膜更高的截留率。

• Immobilon®-FL膜(0.45 μm)是为荧光免疫检测而开发的。它在多种激发和发射波长范围内的荧光背景都极低。

• Immobilon®-E膜(0.45 μm)是第一个用于蛋白质印迹的PVDF膜,可以用水性转移缓冲液润湿。这省去了其他PVDF膜所需的酒精预湿步骤。

Immobilon®转印膜以卷膜和方片膜形式提供。预切好的膜与所有预制胶以及大部分市售的凝胶电泳系统兼容。Immobilon®转印膜的性质详见表2。表3列出了与最常用的电泳系统相匹配的Immobilon®预切膜的尺寸。表4列出了与现有的预制胶相匹配的Immobilon®预切膜的尺寸。

表2. Immobilon® PVDF转印膜的性质和应用


Immobilon®-P转印膜Immobilon®-PSQ转印膜Immobilon®-FL转印膜Immobilon®-E PVDF膜
描述为结合从各种凝胶基质上转移的蛋白质而优化均一的孔径结构带来分子量<20 kDa的蛋白质的出色结合为荧光免疫检测应用而优化首个用于蛋白质印迹的PVDF膜,可以用水性转移缓冲液润湿
组成PVDFPVDFPVDFPVDF
孔径大小0.45 μm0.2 μm0.45 μm0.45 μm
疏水性疏水疏水疏水疏水
应用Western印迹低分子量Western印迹Western印迹
结合分析Western印迹斑点/狭缝印迹
氨基酸分析氨基酸分析荧光免疫检测
N端蛋白测序质谱分析

斑点/狭缝印迹N端蛋白测序

糖蛋白观察


脂多糖分析


质谱分析


检测方法显色显色荧光化学发光
化学荧光荧光显色显色
化学发光化学荧光化学荧光放射性
放射性化学发光化学发光

放射性

蛋白质结合能力胰岛素:160 μg/cm2胰岛素:262 μg/cm2胰岛素:155 μg/cm2胰岛素:160 μg/cm2
BSA:215 μg/cm2BSA:340 μg/cm2BSA:205 μg/cm2BSA:215 μg/cm2
山羊IgG:294 μg/cm2山羊IgG:448 μg/cm2山羊IgG:300 μg/cm2山羊IgG:294 μg/cm2
兼容的可逆染料透射法透射法透射法透射法
丽春红丽春红丽春红丽春红
CPTSCPTSCPTSSypro® ruby
甲苯胺蓝甲苯胺蓝Sypro印迹染料
Sypro®印迹染料Sypro印迹染料

兼容的不可逆染料考马斯亮蓝染料考马斯亮蓝染料考马斯亮蓝染料考马斯亮蓝
氨基黑氨基黑氨基黑氨基黑
印度墨汁印度墨汁
印度墨汁
胶体金胶体金
胶体金

表3. Immobilon® PVDF预切转印膜和匹配的电泳系统

ManufacturerVertical Gel BoxGel size(cm)Immobilon® Size (cm)Immobilon® NOW format compatibleImmobilon®-P 0.45 μmImmobilon®-PSQ 0.2 μmImmobilon®-FL 0.45 μm*Immobilon®-E 0.45 μm
GE HealthcareSE 250 Mighty Small™8 × 78.4 × 7IPVH07850ISEQ07850IPFL07810IEVH07850
SE 260 Mighty Small™8 × 9.58 × 10
IPVH08100ISEQ08100
IEVH08100
miniVE8 × 9.58 × 10
IPVH08100ISEQ08100
IEVH08100
8.5 × 1010 × 10
IPVH10100ISEQ10100IPFL10100
SE 40014 × 1615 × 15
IPVH15150ISEQ15150

SE 60014 × 1615 × 15
IPVH15150ISEQ15150

14 × 813.5 × 8.5IPVH08130ISEQ08130

Bio-RadMini-PROTEAN® 3 Dodeca™8.3 × 7.38.4 × 7IPVH07850ISEQ07850IPFL07810IEVH07850
Criterion™, Criterion™ Dodeca™13.3 × 8.713.5 × 8.5IPVH08130ISEQ08130

PROTEAN® II xi16 × 1615 × 15
IPVH15150ISEQ15150

16 × 2026.5 × 375
IPVH00010ISEQ00010IPFL00010
PROTEAN® II XL19.3 × 18.320 × 20
IPVH20200ISEQ20200IPFL20200
PROTEAN®   Plus Dodeca™20 × 20.526 × 26
ISEQ304F0ISEQ304F0

Mini-PROTEAN® Tetra8.3 × 7.38.4 × 7IPVH07850ISEQ07850IPFL07810IEVH07850
InvitrogenXCell SureLock™ Mini-Cell8 × 88.4 × 7IPVH07850ISEQ07850IPFL07810IEVH07850
XCell4 SureLock™ Midi8 × 138.5 × 13.5IPVH08130ISEQ08130

Thermo ScientificOwl® P81, P82, P8DS10 × 1010 × 10
IPVH10100ISEQ10100IPFL10100
Owl® P82, P8DS8 × 108 × 10
IPVH08100ISEQ08100
IEVH08100
Owl® P9DS16 × 1615 × 15
IPVH15150ISEQ15150

Owl® P10PS20 × 20.520 × 20
IPVH20200ISEQ20200IPFL20200

表4. Immobilon® PVDF预切转印膜和匹配的预制胶

ManufacturerVertical Gel BoxGel size(cm)Immobilon® Size (cm)Immobilon® NOW format compatibleImmobilon®-P 0.45 μmImmobilon®-PSQ 0.2 μmImmobilon®-FL 0.45 μm*Immobilon®-E 0.45 μm
Bio-RadMini-PROTEAN™ TGX, Mini-PROTEAN™ TGX Stain-Free8.6 × 6.88.4 × 7IPVH07850ISEQ07850IPFL07810
Criterion™   TGX, Criterion™ TGX Stain-Free, Criterion™ Tris-HCl, Criterion™ Stain-Free Tris-HCl, Criterion™ XT Bis-Tris13.3 × 8.713.5 × 8.5IPVH08130ISEQ08130

LonzaPAGEr® Gold9 × 108 × 10IPVH08100ISEQ08100
IEVH08100
10 × 1010 × 10
IPVH10100ISEQ10100IPFL10100
NuSepnUView Tris-Glycine, Stain Free8.6 × 6.88.4 × 7
IPVH08100ISEQ08100IPFL07810IEVH07850
8 × 88 × 10
IPVH08100ISEQ08100
IEVH08100
InvitrogenNuPAGE® , Bolt®8 × 88.4 × 7IPVH07850ISEQ07850IPFL07810IEVH07850
Novex®8 × 88.4 × 7IPVH07850ISEQ07850IPFL07810IEVH07850
E-PAGE13.5 × 10.813.5 × 8.5IPVH08130ISEQ08130

ExpedeonRunBlue™ TEO-Tricine SDS8 × 108 × 10
IPVH08100ISEQ08100
IEVH08100
RunBlue™ Tris-Bis10 × 1010 × 10
IPVH10100ISEQ10100IPFL10100
GenscriptExpressPlus™8 × 108 × 10
IPVH08100ISEQ08100IPFL10100IEVH08100
SurePAGE™8.6 × 6.88.4 × 7IPVH07850ISEQ07850IPFL07810IEVH07850
Millipore SigmamPAGE™8.6 × 6.88.4 × 7IPVH07850ISEQ07850IPFL07810IEVH07850
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