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如何选择内参蛋白?
2022.03.15   点击945次

Western Blot实验中经常提到的一个名称——内参。内参即内部参照,一般是指由管家基因编码表达的蛋白,它们在各组织和细胞中的表达相对恒定,在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。

内参的作用很多,其可以确保所有样本的上样量一致,可以作为校正蛋白样品定量以及上样过程中的误差,保证实验结果的准确性,也可以作为空白对照,检测WB过程中蛋白转膜是否完全以及发光显色体系是否正常。

那么在内参的选择上面我们应该注意什么呢?

(1) 根据不同的种属,比如哺乳动物通常选择β-actin、β-tubulin、GAPDH;植物来源实验样本,则可以选择Plant actin、Rubisco等。

(2) 根据蛋白大小选择,一般要选择目的蛋白与内参分子量相差至少5kD以上,才便于对结果分析。且当研究的蛋白的分子量与内参接近时,需要选择分子量与目的蛋白的分子量差距比较大的蛋白。常用内参蛋白的分子量大小见表1。

(3) 根据研究靶蛋白的定位选择内参,比如核蛋白内参可以选择Lamin B、Histone H3等。小编已经将不同来源的蛋白对应常用的内参蛋白信息汇总如下表:

表1. 不同来源的蛋白对应的常用的内参蛋白

样本类型常用的内参蛋白分子量大小(kDa)
全细胞蛋白β-actin43
β-tubulin55
Cyclophilin A55
GAPDH37
α-actin43
α-tubulin55
Cyclophilin A18
Vinculin116
线粒体蛋白Hsp6060
VDCA1/porin31
核蛋白Histone H1/H3 
Lamin B166
PCNA29
TATA binding protein TBP38
HDAC155
细胞骨架β-actin43
β-tubulin55
α-actin43
α-tubulin55
Cofilin20
血清蛋白Transferrin77

(4)根据实验的具体条件选择,有些实验条件会对管家基因的表达有影响而导致部分管家基因不适合做改条件下的内参基因,比如于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达增高,不适合做内参,凋亡实验时,Lamin等也不适合作为内参。

(5)根据样本类型选择内参,比如做各种分泌液样本的时候,如血浆、乳汁、组织液等,由于没有完整的细胞结构,只能选择一些分泌蛋白作为内参。

介绍完了内参的选择,下面我们来介绍下今天的主角GAPDH、β-actin和β-tubulin。这3个WB实验中最常用内参。

1. GAPDH抗体

【GAPDH】甘油醛-3-磷酸脱氢酶,是参与糖酵解的一种关键酶,催化糖酵解的第六步,它还参与核转录等事件,核糖核酸转录、DNA复制和修复以及细胞凋亡。由4个30-40 kDa的亚基组成,分子量146kDa,检测条带大约在36kDa。GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达,广泛用作WB的内参。

2. β-Tubulin抗体

Tubulin即微管蛋白,是细胞的一种骨架蛋白。Tubulin分为α、β、γ、δ、ε等多种tubulin,其中α-Tubulin和β-Tubulin可以形成异源二聚体,是形成微管的最主要的两种Tubulin。α-tubulin和β-tubulin分子量分别为55kDa和50kDa,其实际检测条带均在55kDa左右。作为内参,β-tubulin的蛋白水平通常不会发生改变,因此被广泛用于Western Blotting时上样量是否一致的参照,α-Tubulin和β-Tubulin构成微管蛋白的结构也常被用于免疫染色观察细胞的微管结构。

3. β-Actin内参抗体

Actin即肌动蛋白,是细胞的一种重要骨架蛋白。Actin大致可分为六种,其中四种是不同肌肉组织特异性的,其余两种广泛分布于各种组织中,包括 β-actin和γ-non-muscle actin。β-actin作为内参是得到了公认的,这是针对大多数组织和细胞来说的,它广泛分布于细胞浆内,表达量非常丰富,其含量占所有细胞总蛋白的50%。但是在一些少量特殊的情况下,如脂肪组织或细胞β-Actin抗体推荐—高效价的内参抗体内,β-Actin的表达量就很少。β-actin由375个氨基酸组成,分子量大小为42-43kDa左右。

以上三种内参可以满足80%以上的WB实验需求,Abbkine推出的通用内参抗体鸡尾酒,是一种包含了免疫实验(WB、IHC-P、IF)过程中常用的抗体β-Actin、GAPDH和β-Tubulin以及抗体稀释液的套装,并提供了阳性对照,是WB等实验内参的不二之选。

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